Protein-Protein İlişkilerini Belirlemede Yeni Bir Yöntem: “Proksimiti Ligasyon Assay” (Yakınsal Bağlanma Tespiti)

yücel erbilgin, Özden Hatırnaz Ng, Müge Sayitoğlu, Ola Söderberg, Uğur Özbek
917

Öz


Amaç: Sinyal yolakları ve proteinlerin fonksiyonel olarak derinlemesine çalışılmasının gerekliliği nedeni ile, proteomiks çalışmalarında protein-protein etkileşimlerinin analizi her geçen gün daha da önemli hale gelmektedir. Proksimiti ligasyon assay, hücre ve doku kesitlerinde hücre içi proteinlerin ve protein interaksiyonlarının keşfedilmesi amacı ile kullanılan yeni bir yöntemdir. Bu çalışmada, PLA yöntemini kullanarak, WNT sinyal ileti yolağı proteinlerinden b-katenin ve Axin2 proteinlerinin etkileşimlerini bir T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) hücre hattı olan Jurkat hücrelerinde göstermeyi amaçladık.

 

Gereç ve Yöntem: Jurkat hücreleri RPMI' lı besi yerinde yetiştirilip lamlara fikse edilir. Geçirgen hale getirilen hücreler blokaj aşamasından ardından birincil antikorlar ve PLA probları ile muamele edilirler. Hibridizasyon ve ligasyonunun ardından sirküle oligonükleotidler, sirküle dönen amplifikasyon (RCA) için substrat oluştururlar. RCA ürünleri Texas Red işaretli probların hibridizasyonu ile işaretlenir ve in situ PLA sinyalleri floresan mikroskobunda görüntülenir.

Bulgular: Öncelikle hücre içi b-katenin and Axin2 protein ekspresyonları belirlendi. Ardından b-katenin-Axin2 protein interaksiyon varlığı hem nükleus hem de sitoplazmada gösterildi.

Sonuç: Burada sunulan sonuçlar, in situ PLA tekniğinin, WNT yolağı üyelerinin birbirleri ile olan etkileşimlerinin hücresel boyutta tespit edilmesinde kullanılabileceğini göstermiştir. Çalışmamızda, artmış düzeyde b-katenin-Axin2 protein etkileşimini T-ALL hücre soyunda (Jurkat) gösterdik. Bu WNT sinyal yolağının T-ALL de bozulmuş regülasyonuna işaret ettiğini göz önünde bulundurursak WNT yolağı elemanları yeni tedavi protokolleri için birer hedef molekül halini alabilirler.